白芷试管组织培养技术

组织培养是指在无菌条件下，对植物的某一器官、组织，甚至细胞、原生质体等进行的离体培养。通过这一培养，可以对植物进行快速无性繁殖，尤其是种源缺乏或种子不易萌发，繁殖率低，周期长等情况下，此法有很大的优越性；还可用于培育优良品种，并将优良单株大量快速繁殖；另外，从药用植物工业化生产的发展前景来看，利用细胞或原生质体培养，还可以直接生产有效成分，等等。以下将白芷目前组织培养方面的研究情况做一回顾。对进行了组织培养再生植株的研究：取2-3年生白芷植株的幼叶为外植体，以MS为基本培养基，附加水解酪蛋白0.5-1毫克/升，按需要加入2，4-D和BA。幼叶经0.1%升汞液表面灭菌、无菌水浸洗后分别将叶片与叶柄切块接种于含有不同浓度组合的2，4-D与BA的MS培养基上进行培养。培养温度为25℃-28℃，光照用30W荧光灯，培养材料距灯管20-40厘米，每天照光10-12小时。

结果：白芷的叶柄为松软的海绵状组织，其外植体在含有不同激素的MS培养基上长期培养，未见启动；幼叶叶片切块在MS附加2，4-D 0.5-2 BA0.2毫克/升培养基上暗处培养70多天，获得可转接的愈伤组织，将其转接到MS附加2，4-D0.01-0.1毫克/升 BA0.01-0.1毫克/升培养基上后，在光照条件下分化出珠状结构的芽，其大小如豌豆，形似荸荠。进而幼叶2-3片破鞘状体而出，基部长出粗状的根，形成了完整的小植物；若转接到低浓度的2，4-D与BA的MS培养基上，仍在暗处培养，则形成大量团状愈伤组织，并从其局部分化出胚状体，在光照条件下，胚状体经不同发育时期形成再生植株。再生植株的移栽成活率可达100%，植株生长良好，能正常开花结实。对川白芷［A.dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f. var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan］进行了再生植株的研究。经多组实验研究，最终选择了叶轴为最佳外植体：取2年生川白芷生长健壮的植株，割取其叶轴部分，清水洗净，用0.1%的升汞液表面消毒12分钟，无菌水漂洗5次，在无菌条件下切割接种在MS附加BA1、NAA0.5的培养基上，培养温度为25±2℃，光照每天8小时，光照强度1500LX。培养25天后，出愈率达到100%，且愈伤组织质地较致密，生长速度适中。继续培养至60天后，芽分化率达98%，且绿色丛生芽量多，表现出生机旺盛。当试管苗长至约2.5-3厘米左右高时，从基部切下，接种在1/2MS NAA1、蔗糖减至1.5%的生根培养基上，约10天以后，从切口处开始产生白色突起，20天后多数刷把状粗状的根产生了，平均每株产根10-15条，生根率达95%以上；待根长至1.5-2厘米左右时，直接移出瓶外，洗净其上的培养基，移入小钵中，先期罩一薄膜袋保湿，约一周后拿掉薄膜袋，每天浇一次水，二周后，移入田间，使其在自然条件下生长，移栽成活率100%。

在本实验研究过程中还发现，川白芷组织培养中，加入2，4-D的效果不如NAA与BA结合使用的效果好；叶轴、叶柄为愈伤化明显的外植体，而叶片与子叶启动无效；光照下培养25天，愈伤化明显，50天后便可获得可转接的愈伤组织。而在白芷经胚状体途径再生植株的实验中，愈伤组织的生长有赖于2.4-D的加入，且认为叶片为理想的外植体，而叶柄则长期未见启动；要获得可转接的愈伤组织需暗培养70多天。由此可见，不同种类的白芷在选择外植体和形成愈伤组织的培养条件上是不相同的。

一、原生质体的游离和培养

将上述愈伤组织继代6-8天后取出置于不锈钢筛网上，用含5毫米ol/升Cacl2的0.6mol/升甘露醇溶液冲散，滤下单细胞，取网上细胞团，置于酶液中游离原生质体。酶液组成为：纤维素酶1.5% 离析酶0.5% 蜗牛酶(中国科学院生物物理研究所)0.5% 葡聚糖硫酸钾0.3% Cacl2 5毫米ol/升 甘露醇0.6mol/升，pH5.8。在黑暗中保温5小时，酶混合物经300目筛网过滤，滤液在500rpm下离心5分钟，去掉酶液，收集原生质体并用含5毫米ol/升 Cacl2的0.6mol/升甘露醇洗涤2次，原生质体培养基洗涤1次，然后以2×10　5/毫升密度重新悬浮于培养液中，吸取0.8毫升悬浮液于直径3.5厘米小培养皿中，加入0.2%琼脂糖软包埋培养。

原生质体培养基(MSIA)采用MS无机盐及有机成分，附加葡萄糖90000毫克/升(以下单位同)、蔗糖10000，水解酪蛋白500、D-核糖250、D-木糖250、谷氨酰胺100、天冬氨酸20、甘氨酸2、半胱氨酸2、抗坏血酸2、椰乳20毫升。培养基中加入激素2，4-D 1 玉米素(Z)0.5。在MSIA中，培养到第7天，原生质体再生细胞开始分裂，15天左右形成十几个细胞的细胞团。培养20天后，当有较多细胞团形成时，分作不同处理，添加不同渗透压及激素组合的培养液。每10天加液1次，每次0.25毫升，最后一次添液后10天，观察结果如下表：

不同的加液方法MSIA加液4次MSIA加液3次，MSIA加液1次MSIA加液3次，MSIA加液1次MSIA加液4次。

细胞团发育成球形胚比例（%）-60 -85-20 -15

球形胚大小1毫米以下10%大至1.5-2毫米3%大至1.5-2毫米1毫米以下

二、 体细胞胚的形成及植株再生

添加不同渗透压及激素培养液对球形胚形成的影响

配制原生质体再生愈伤组织增殖培养基MSⅡ：MS 2，4-D0.5、蔗糖30克/升；体细胞胚发生发育培养基MSⅢ：MS、蔗糖20克/升；胚根发育培养基MSIV：MS NAA1、蔗糖20克/升。2个月左右，当原生质体再生的细胞团形成肉眼可见的球形胚及小愈伤组织后，将1.5-2毫米以上的球形胚直接转入MSⅢ中继续发育。其余的培养物分别转到MSⅡ及MSⅢ中增殖及分化。

在MSⅡ中，小愈伤组织继续生长形成愈伤组织，1毫米以下的球形胚大多数形成多级胚聚合体，1.5-2毫米以上的球形胚变化不明显。

在MSⅢ中，小愈伤组织开始时继续生长，半月后变慢，最后分化出体细胞胚。1毫米以下的球形胚部分变褐；另一部分先形成多级胚，然后从多级胚团块上先后长出较大的球形胚并发育成子叶胚。1.5-2毫米以上的球形胚体积增大，随之长出子叶，形成子叶胚。

以上在MSⅡ中的愈伤组织，转移至MSⅢ中，在表面上长出球形胚和子叶胚。不同来源的子叶胚在MSⅢ中长出绿色正常的叶片，但胚根极少发育，转移到MSIV中诱导生根并发育成完整植株。取川白芷叶轴切段，用培养基MS 6-BA 1 NAA0.5，在25℃±2℃、1500LX、光照每天8小时条件下培养。当叶轴外植体块上刚刚开始出现不定芽分化时(外观为绿色芽点)，立即用无菌秋水仙液处理，最佳浓度0.025%，处理时间以24小时为宜。处理完将处理液及时倒出，用无菌水反复冲洗，转入新的培养基中继续培养。由于处理液具有一定的毒性，所以在诱变过程中不定芽也有许多损伤，统计不定芽存活率约为53.3%，以存活率为基数的不定芽诱变率约为68.9%。经诱变处理的小苗从外观和显微特征上均出现了多倍体的一些特征，如叶片加厚，叶色深绿(含叶绿素数目增多)，气孔增大，染色体数目从2n＝22增至2n＝44等。此实验研究为白芷的多倍体培育探索了一条有效的途径。